Improved Stratification → CA125 & HE4

کارسینوم تخمدان پنجمین عامل مرگ ناشی از سرطان در زنان می باشد و تشخیص بیماری در مراحل اولیه، شانس بقای بیمار را افزایش می دهد.

استاندارد طلایی جهت پایش کارسینوم تخمدان بیومارکر CA125 است اما این مارکر محدودیت هایی دارد که عبارتند از:

• در ۲۰٪ از کانسرهای تخمدان افزایش نمی یابد.
• در بیماری های خوش خیم گروه زنان نیز افزایش می یابد.
• در بعضی بیماری های غیر زنان نیز افزایش می یابد.
• به علت محدودیت هایی که CA125 دارد نیاز به یک بیومارکر دیگر جهت افزایش حساسیت و به خصوص استفاده از آن در مراحل اولیه ضروری به نظر می رسد.

:HE4

پروتئین HE4 یک بیومارکر جدید سرمی می باشد که به طور نرمال در بافت اپی تلیال وجود دارد و سطح آن در کارسینوم تخمدان بالا می رود.

مزایای اندازه گیری HE4  :

• جهت پایش پاسخ به درمان و عود در کانسر اپی تلیال تخمدان،  حساسیت ترکیب (CA125 & HE4 ) بیشتر از مارکر CA125 به تنهایی می باشد.
• بالاتر بودن حساسیت HE4 در مرحله اولیه در مقایسه با CA125
• بالاتر بودن حساسیت HE4 در زنان پره منوپوز در مقایسه با CA125

HE4 بیشتر به همراه مارکر CA125 جهت طبقه بندی ریسک Risk Stratification کانسراپی تلیالی تخمدان در زنان با توده لگنی قبل و بعد از منوپوز بکار می رود.

  ROMA: (Risk of Owarian Malignancy Algorithm)

این فاکتور یک ابزار طبقه بندی خطر است که با ترکیب دو مارکر محاسبه کرده و بیمار را در دو گروه پرخطر و کم خطر طبقه بندی می کند.

 ROMA۸۹٪   زنان مبتلا به کانسر اپی تلیالی تخمدان را در گروه با ریسک بالا و ۷۵٪ زنان مبتلا به بیماری خوش خیم را در گروه با ریسک پایین طبقه بندی می کند.

هیپوگنادیسم اولیه Primary Hypogonadism در زنان بعنوان نارسایی تخمدان (ovary failure) تعریف می شود که با غلظتهای بالای هورمون FSH همراه است.

Premature ovary failure  یا نارسایی زودرس تخمدان که جدیدا با نام (POI) primary ovary insufficiency     شناخته می شود بعنوان هیپوگنادیسم اولیه در زنان زیر ۴۰ سال تعریف می شود. در POl بعلت کاهش یا عملکرد نادرست فولیکولهای تخمدان Amnorraea یا توقف قاعدگی ایجاد می شود که شایعترین نشان POl است.

شیوع POI در زنان مبتلا  به آمنوره ۲٪ – ۱۰ می باشد. دلایل متعددی از قبیل ناهنجاری های کروموزومی مثل     Fragil X و Turner Syndroms ، برخورد با اشئه و داروهای شیمی درمانی،  بیماری های اتوایمیون و با احتمال کمتر عفونتها و جراحی ها برای POl ذکر شده اند.

جراحی لگن ممکن است به نقص عملکرد تخمدان منجر شود . تقریبا ٪۴ زنانی که POl دارند آنتی بادیهای تخمدانی و آدرنال را خواهند داشت. اختلالات غددی از قبیل آدرنال ، تیروئید و پاراتیروئید ممکن است با POl همراه باشند.

زنان مبتلا به اPO با کاریوتایپ نرمال ۶٪ حامل premutation در ژن FMR1 می باشند.

POl با کاهش اووسیت ها، نبود فوليکوژنز و تولید استروژن و ناباروری مشخص می شود. بعلت وجود بیماری های دیگر بهمراه POI پتانسیل اختلالات کروموزومی ارثی ژنتیکی و اتوایمیون باید مورد توجه قرار گیرند.

تشخیص آزمایشگاهی POI

Initial Lab Evaluation:

FSH          Τ3         TSH

LH             T4         AMH

PRL          T3UP    Estradiol

If FSH2 menopausal Range: a repeated FSH indicated in 1 month

:If diagnosis is confirmed, further testing to investigate etiology of POI

ATA           Кагуotype

AMA          ANA

AOA          Cortiso

(ACTH        FMR permutaation (fragil x

سندرم تخمدان پلی کیستیک یا PCOS شایعترین تظاهر اختلالات هورمونی و متابولیکی زنان در سنین باروری است و شایع ترین علت نازایی زنان هم محسوب می شود.

تشخیص PCOS هنگامی میسر است که بر مبنای معیار روتردام ۲ مورد از ۳ عامل زیر در بیمار وجود داشته باشد:

۱. وجود تخمدانهای پلی کیستیک در سونوگرافی

۲. سطوح بالای هورمونهای آندرژون و یا علائمی که بیانگر افزایش هورمون های مردانه هستند نظیر (هیرسوتیسم، آکنه و …)

۳. اختلال در قاعدگی

خطرات PCOS :

1. Insulin Resistance
2. Obesity
3. Type 2 diabetes
4. Cardiovascular disease
5. Metabolic Syndrome
6. Endometrial Cancer
7. Infertility

سقط مکرر به سه نوبت (یا بیشتر) از دست رفتن حاملگی قبل از هفته ۲۰ بارداری اطلاق می شود که با ناباروری متفاوت است. حدود ۱۵ تا ۲۵ درصد زنان با بارداری شناخته شده تجربه یک بار و تنها یک درصد دارای سابقه ۳ بار سقط متوالی هستند. زوج هایی که این مسئله را تجربه می کنند نیازمند ارزیابی های پزشکی و حمایت روانی اند.

علل ایجاد سقط مکرر

متاسفانه علت سقط مکرر تنها در ۵۰ درصد بیماران مشخص می شود و علت مابقی ناشناخته است. محققان عوامل متعددی را در بروز سقط دخیل می دانند که در اینجا به مهمترین آنها اشاره می شود:

1. علل ژنتیکی و کروموزومی

ناهنجاری در ساختمان و یا تعداد کروموزوم ها علت حدود ۵۰ درصد سقط های زود هنگام تک گیر می باشد. از میان آنها جابجایی کروموزومی یا Translocation شایعترین ناهنجاری ارثی می باشد. درصد معناداری از سقط مکرر نیز با ناهنجاری در ساختمان و یا تعداد کروموزوم (نظیر آنپلوئیدی، موزائیسم، جابجایی کروموزومی یا حذف و یا معکوس شدن کروموزومی) در ارتباط می باشد. جابجایی کروموزومی در ۴ درصد زوج های دارای سقط مکرر دیده شده است در حالیکه این افراد خود سالم می باشند.

۲. سن

با بالا رفتن سن مادر احتمال بروز سقط افزایش می یابد بطوریکه پس از ۴۰ سالگی تقریبا 1/3 بارداری ها به سقط می انجامد و این میزان پس از ۴۵ سالگی تقریبا به ۸۰ درصد می رسد. هم چنین افزایش سن پدر نیز امروزه بعنوان عامل خطر زا در بروز سقط مکرر مطرح است.

۳. اختلالات غدد درون ریز

ناهنجاری های هورمونی علت ۱۵ تا ۶۰ درصد سقط های مکرر به شمار می رود، این اختلالات عبارتند از:

نقص فاز لوتئال  (Luteal Phase Defect)

پروژسترون عامل مهم جهت لانه گزینی و تداوم بارداری می باشد، بنابراین اختلال در تولید و یا عملکرد پروژسترون بر روند بارداری تاثیر مستقیم دارد. نقص فاز لوتئال که با نقصان تولید پروژسترون همراه است می تواند در بروز سقط نقش داشته باشد گرچه در این زمینه اختلاف نظرهایی وجود دارد.

دیابت

دیابت ملیتوس کنترل نشده می تواند با سقط مکرر همراه شود. مطالعات متعدد ارتباط مستقیم بین افزایش میزان هموگلوبین گلیکوزیله ( Hb A1 c) و بروز سقط و بد شکلی های مادرزادی را نشان داده است.

سندروم تخمدان پلی کیستیک PCOS) (

میزان سقط در افراد مبتلا به PCOS حدود ۲۰ تا ۴۰ درصد می باشد. مکانیسم های دخیل در این زمینه گرچه ناشناخته است اما می تواند با مقادیر افزایش یافته LH ، تستوسترون و آندرستندیون سرم که بر آندومتر تاثیر نامطلوب دارد و یا مقاومت به انسولین که در این بیماران مشاهده می شود، مرتبط باشد.

اختلال هورمون های جنسی که در افراد مبتلا به PCOS پدیدار می شود همچنین می تواند سبب تخمک گذاری زود و یا دیر هنگام، پذیرش ضعیف آندومتر، آشفتگی در تولید، ترشح و عملکرد پروستاگلاندین ها، عوامل رشد و سیتوکاین ها شود که در حفظ و سلامت بارداری موثرند.

بیماری های غده تیروئید

میزان سقط در زنان دارای مقادیر بالای آنتی بادی های تیروئیدی ( آنتی TPO و یا آنتی TG) نسبت به زنان طبیعی بیشتر می باشد. بیماری های خود ایمن تیروئید با دلایل نامشخص می تواند با نقص در لانه گزینی و ناباروری همراه باشد. پرکاری و کم کاری کنترل نشده غده تیروئید نیز با ناباروری و سقط در ارتباط است.

هیپرپرولاکتینمیا:

 پرولاکتین موجود در سرم، در مقدار طبیعی، نقش مهمی در حفظ بارداری و تداوم آن دارد. در افراد دچار هیپرپرولاکتینمیا درمان های پایین آورنده میزان پرولاکتین با میزان بالای موفقیت بارداری همراه بوده است.

۴. ناهنجاری های رحمی

 بد شکلی های مادرزادی رحم در ۱۰ تا ۱۵ درصد زنان دارای سابقه سقط مکرر دیده شده است. از دست رفتن حاملگی می تواند به علت اشکال در Distention رحم و یا لانه گزینی باشد. رحم دارای تیغه که شایعترین بد شکلی رحم است با ضعیف ترین احتمال در موفقیت بارداری همراه می باشد بطوریکه شانس زنده ماندن جنین در موارد درمان نشده تنها ۶ تا ۲۸ درصد و میزان سقط بالاتر از ۶۰ درصد می باشد. لیومیوما، پولیپ های اندومتر و چسبندگی داخل رحم نیز از دیگر ناهنجاری های رحم اند که با سقط مکرر مرتبط می باشد.

۵. ترومبو فیلی و عوامل فیبرینولیتیک

ایجاد لخته در عروق بخش مادری جفت که کاهش و یا نقص در گردش خون جفت را سبب می گردد. می تواند سبب سقط دیر هنگام جنین، محدودیت رشد داخل رحمی، پارگی جفت و یا مسمومیت حاملگی شود. بیماری های ارثی که با افزایش احتمال لخته در مادر همراه اند مرگ جنین در نیمه دوم بارداری را باعث می شود ولی ارتباط آنها با بروز سقط در نیمه اول بارداری چندان روشن نمی باشد.

۶. عوامل محیطی و استرس

علی رغم توجه بیماران شواهد نسبی بر وجود ارتباط بین عوامل مربوط به شغل، استرس و تماس با مواد شیمیایی محیط با سقط مکرر وجود ندارد.

۷. عوامل دیگر

ارتباط بین سقط مکرر با چاقی، مصرف دخانیات، الکل و کافئین نا مشخص می باشد. برخی عوامل عفونى نظير لیستريا مونوسيتوژنز، توکسوپلاسما گوندی، ویروس سیتومگال و ويروس هرپس سیمپلکس عوامل شناخته شده ای در ایجاد سقط های تک گیر می باشد، اما ارتباط انها با سقط مکرر به اثبات نرسیده است.

میزان FSH و استرادیول روز سوم در زنان دارای سقط مکرر با علت نامشخص بالاتر از زنانی است که سقط مکرر با علت شناخته شده دارند. میزان FSH در این روز بیانگر میزان ذخیره تخمدانی، کیفیت و کمیت اووسیت ها می باشد که در میزان باروری دخالت مستقیم دارد. مطالعات جدید نشان می دهد میزان بروز سقط مکرر در زنانی که همسران آنها دارای آنالیز اسپرم غیر طبیعی بوده و یا ناهنجاری در DNA اسپرم دارند، بالاتر از سایر زنان می باشد.

بیماری سلیاک درمان نشده حتی اگر در فرم تحت بالینی باشد با از دست رفتن حاملگی، اختلال در سیکل ماهانه و نه باروری همراه است و به نظر می رسد که درمان بیماری در بهبود مشکلات فوق موثر است.

تشخیص آزمایشگاهی سقط مکرر

مهمترین بررسی های آزمایشگاهی که در تشخیص، ارزیابی و روند درمانی RPL مورد استفاده قرار می گیرند عبارتند از:

آنتی بادی های ضد فسفولیپید APL))

گروهی از آنتی بادی های غیر اختصاصی برای ارگان اند که حضورشان همراه با نارسایی درباروری است. این نارسایی از نظر بالینی می تواند به صورت سقط مکرر، ناباروری با علت نامشخص و ناباروری در اثر اندومتریوز نمایان شود. این آنتی بادی ها با ایجاد لخته نیز در ارتباط اند. انجام این آزمایش برای تمام بیمارانی که سابقه ۲ یا بیشتر سقط متوالی اند، بیماران با اندومتریوز، عدم موفقیت IVF به علت نارسایی در کاشت، سندروم تخمدان نارس، ناباروری با علت نامعلوم و بیماران مشکوک به لوپوس اریتماتوز توصیه می شود. آزمایش به روش الایزا انجام می پذیرد و طی آن دو کلاس آنتی بادی ( lgG – lgM) اندازه گیری می شود.

آنتی بادی های ضد کاردیولیپین(ACA)

انتی بادی هایی هستند که اغلب بر علیه کاردیولیپین ایجاد می شود که یک فسفولیپید غشایی است. این آنتی بادی ها در بیماری های متعددی نظیر لوپوس اریتماتوز، سندروم آنتی فسفولیپید، واسکولیت و سقط های خود به خودی وجود دارد. حضور این آنتی بادی ها در تعداد زیادی از زنان نابارور و دارای سقط مکرر نشان دهنده نقش ایمونولوژیک آنها در ممانعت از بارداری می باشد. آنتی بادی های کاردیولیپین در سه کلاس IgM ,IgG ,IgA وجود دارند که به روش الایزا قابل تشخیص و اندازه گیری می باشد.

ضد انعقاد شبه لوپوس ( (LAC

این ضد انعقاد یک انتی بادی ضد فسفولیپید می باشد که مستقیما بر علیه فسفولیپید های با شارژ منفی تولید می شود و خود را با افزایش زمان PT، aPTT و یا  dRVVT نشان می دهد. حضور این ضد انعقاد با گستره بالینی متنوعی شامل حوادث ترومبوآمبولی شریبانی و وریدی، کاهش پلاکت و سقط مکرر همراه می باشد. حضور LAC در 1 تا 5 درصد زنان دچار سقط مکرر نشان داده شده است. انجام این آزمایش در تمام بیماران دارای سابقه ترومبوز شریانی و یا وریدی، لوپوس اریتماتوز و زنان دارای سابقه ۲ و یا بیشتر سقط توصیه می شود. آزمایش به روش کو آگلومتری انجام می شود و در حقیقت یک روش غربالی می باشد.

آنتی بادی های ضد تیروئید

آنتی میکروزومال ((Anti TPO و آنتی تیروگلوبولین (Anti TG)

اختلالات خود ایمن غده تیروئید با حضور آنتی بادی های ضد تیروئید شامل Anti TPO و Anti TG مشخص می شوند. این آنتی بادی ها شاخص های مستقلی برای خطر از دست رفتن حاملگی می باشد. زبان دارای انتی بادی های ضد تیروئید نسبت به زنان فاقد آن ۲ برابر بیشتر دچار سقط می شوند و تقریبا  30% زنان دارای سقط مکرر دارای تیتر های افزایش یافته یک یا هر دو آنتی بادی ضد تیروئید می باشد. انجام آزمایش اندازه گیری آنتی بادی های ضد تیروئید در بیماران دارای سابقه ناکفایتی تیرویید، زنان نابارور با علت نامشخص و زنان دارای سقط های مکرر توصیه می شود. از آنجا که در زنان دارای آنتی بادی های ضد تیروئید در سه ماهه اول بارداری شانس سقط و یا بروز اختلال عملکرد تیروئید بعد از زایمان حدود ۵۰ درصد می باشد، انجام آزمون فوق برای تمام زنان در سه ماهه اول بارداری توصیه می شود.آزمون فوق به روش الایزا و یا کمی لومینسانس انجام می پذیرد.

ترومبوفیلی های مادرزادی

بیماری های ژنتیکی اند که خطر بروز ترومبوآمبولی را افزایش می دهد که در طی بارداری به علت تغییراتی که رخ می دهد این احتمال افزایش می یابد. حوادث ترومبو آمبولیک در بروز سقط های مکرر نقش داشته و تمامی زنان باردار دارای سابقه سقط باید از نظر این بیماری های ژنتیکی بررسی شوند.

آزمون های ذیل در تشخیص عوامل ترومبوفیلیایی سقط مکرر انجام می گردد:

CS پروتئین، پروتئین های C , S هر دو وابسته به ویتامین K بوده و در کبد سنتز می شوند. پروتئین C مهار کننده برخی از فاکتورهای انعقادی بوده و پروتئین S بعنوان یک کوفاکتور برای پروتئین C عمل می کند. کمبود مادرزادی هر دو پروتئین شناخته شده، که می تواند در بروز ترومبوزهای وریدی نقش داشته باشد. میزان پروتئین C و S در خون بروش الایزا قابل اندازه گیری می باشد.

آنتی ترومبین III

گلیکوپروتئینی غیر وابسته به ویتامین K می باشد که در کبد تولید شده و مهمترین مهار کننده ترومبین و سرین پروتئازهای انعقادی می باشد. کمبود مادرزادی آنتی ترومبین امی تواند در بروز ترومبوزهای وریدی نقش داشته باشد. میزان آنتی ترومبین III بروش الیزا قابل اندازه گیری است.

PT-APTT

این آزمایش ها جهت ارزیابی مسیرهای داخلی و خارجی سیستم های انعقادی انجام می شود. افزایش ΡΤ در کمبود فاکتورهای مسیر خارجی و نیز در اختلالات انعقادی ارثی، بیماری کبد، کمبود ویتامین K و درمان با وارفارین دیده می شود. افزایش APTT در کمبود فاکتورهای مسیر داخلی و وجود مهارکننده های غیر اختصاصی همانند:  LAC Lupus Anti Coagulant)) و در درمان با هپارین دیده می شود.

هموسیستئین  و موتاسیون (Methylene Tetra Hydro Folate Reductase) MTHFR

هموسیستئین اسید آمینه ای است که از تبدیل متیونین به سیستئین ایجاد می شود و دارای خواص آتروژنیک و پروترومبوتیک می باشد. افزایش میزان هموسیستئین خون در اثر نقص مادرزادی آنزیم های در گیردر متابولیسم این اسید آمینه رخ می دهد که مهمترین آن هاMTHFR می باشد، شواهد بالینی نشان داده که افزایش هموسیستئین در خون می تواند به عنوان عامل خطر در بروز بیماریهای ترومبوامبولیک وریدی عمل نماید. مهمترین علت ژنتیکی افزایش هموسیستئین در خون ایجاد موتاسیون در آنزیم MTHFR بوده که در طی آن فعالیت آنزیم کاهش می یابد    (T mutation) و به حرارت حساس می گردد. هموزیگوت های این موتاسیون  (TT) دارای مقادیر افزایش یافته هموسیستئین در خون می باشند که اغلب با کاهش اسید فولیک سرم هم همراه است.

موتاسیون MTHFR با روش PCR قابل تشخیص و شناسایی بوده و میزان هموسیستئین در خون به روش الایزا اندازه گیری می شود.

موتاسیون پروترومبین (Prothrombin Mutation)

پروترومبین پیش ساز ترومبین محصول نهایی آبشار انعقادی و پروتئینی وابسته به ویتامین K است که در کبد سنتز می شود. موتاسیون ژن پروترومبین خطر بروز ترمبوزهای وریدی در طی بارداری را افزایش می دهد. ژن پرو ترومبین بر روی کروموزوم ۱۱ واقع شده است. این موتاسیون باعث جانشینی آدنین بجای گوانین در موقعیت ۲۰۲۱۰ ژن پروترومبین شده که بصورت G20210A نشان داده می شود در افراد هتروزیگوت برای این موتاسیون مقدار پروتئین ۳۰ درصد بالاتر از افراد طبیعی است، موتاسیون ذکر شده به روش PCR قابل شناسایی می باشد.

موتاسیون فاکتور V   (فاکتور لیدن G1691 A Leiden )

فاکتور لیدن شایعترین علت ترومبوفیلیایی مادرزادی می باشد. فاکتور V در پلاسما به فرم غیر فعال حضور دارد که تحت تاثیر ترومبین به فرم فعال خود در می آید که به نوبه خود کوفاکتور تبدیل پروترومبین به ترومبین می باشد. فاکتور V فعال شده تحت تاثیر پروتئازها (پروتئین  (Cغیرفعال می گردد. فاکتور V موتاسیون یافته که بعنوان فاکتور لیدن شناخته می شود، کمتر تحت تاثیر پروتئین C غیر فعال می شود و بنابراین فاکتور V فعال بیشتری در گردش خون وجود داشته که به نوبه خود با تولید بیشتر ترومبین زمینه انعقاد را افزایش می دهد.موتاسیون فاکتور V بروش PCR قابل تشخیص و شناسایی است و مقاومت به پروتئین C که در ۹۵ – ۹۰ درصد موارد بعلت وجود فاکتور لیدن می باشد به روش سرولوژیک قابل اندازه گیری می باشد.

مو تاسيون فيبرينوژن (Beta-Fibrinogen Mutation  )

فیبرینوژن یکی از مهمترین پروتئینهای آبشار انعقادی می باشد که موتاسیون در موقعیت ۴۵۵ ناحیه پروموتری زنجیره بتای آن (G-455A )، باعث افزایش میزان فیبرینوژن شده و خطر ترومبوز را افزایش می دهد. بررسی این موتاسیون با استفاده از روشهای آنالیز DNA قابل انجام می باشد.

موتاسیون Plasminogen Activator inhibitor)PAl)

1-PAI اصلی ترین مهارکننده فعال کننده های پلاسمینوژن در پلاسما می باشد که قادر است به سرعت هم فعال کننده بافتی پلاسمینوژن ( PA-t ) و هم فعال کننده پلاسمینوژن اوروکینازی (u-PA) را غیر فعال نماید  PAI-1 در کبد و سلول های اندوتلیالی تولید شده و تولید آن تحت تاثیر واسطه های فیزیولوژیک می باشد.

PAI-1  مهمترین مهار کننده سیستم فیبرینولیتیک بوده و بنابراین مقادیر افزایش یافته آن با مهار فیبرینولیز ریسک بروز ترومبوز را افزایش می دهد. مقادیر سرمی PAI-1 تحت تاثیر عوامل محیطی و ژنتیکی می باشد. تحقیقات نشان داده پلی مورفیسم ژن PAI-1 در میزان سرمی آن تاثیر می گذارد.

افراد دارای ژنوتیپ 4G/4G بیشتر بن مقدار  PAI-1و افراد 5G/5G کمترین مقدار 1-PAl را دارا می باشند. بطوریکه میزان PAI-1 در 4G/4G به حدود ۲۵ درصد بالاتر از افراد دارای ژنوتیپ 5G/5G باشد تعیین ژنوتیپ PAI-1 به روش PCR قابل شناسایی و تشخیص است.

موتاسیون فاکتور  (V34L) XIII

فاکتور XIII یا فاکتور تثبیت کننده فیبرین، آنزیمی است که در روند تشکیل لخته اتصال بین رشته های فیبرین را انجام می دهد. این فاکتور توسط ترومبین و کلسیم فعال شده و باعث پایداری لخته و مقاومت آن در برابر فیبرینولیز می گردد. موتاسیون در اسید آمینه سی و چهارم این پروتئین که باعث تغییر والین به لوسین می شود ( موتاسیون V34L  (با توجه به تاثیر آن بر ساختار رشته های فیبرینی در لخته، باعث کاهش احتمال ترومبوز می گردد. بررسی این موتاسیون با استفاده از روشهای آنالیز DNA قابل انجام است.

موتاسیون آنتی ژن پلاکتی HPA-1 Mutation – Glycoprotein PLA1 / PLA2) )

یکی از عوامل اصلی تجمع پلاکتی در لخته، اتصال پلاکتها و فعال شدن آنها از طریق گلیکوپروتنین سطحی GPIIIa می باشد. این گلیکوپروتئین حاوی اپی توپی به نام آنتی ژن پلاکت انسانی ( 1- ( HPAیا آنتی ژن پلاکتی (PLA ) است که محل اتصال فیبرینوژن می باشد.این آنتی ژن دارای دو آلل (HPA-1a (PLA1 و (HPA-1 b (PLA2 است که آلل HPA-1b ناشی از جایگزینی اسید آمینه پرولین به جای لوسین در موقعیت سی و سوم این پروتئین می باشد.

(موتاسیون Leu33Pro یا  ( T196Cکه بروز این موتاسیون باعث می شود تا زمینه ترومبوز در افراد  دارای آلل HPA-1b DNA بیشتر باشد. بررسی این موتاسیون با استفاده از روش های آنالیز DNA قابل انجام می باشد.

جایگاه  PCR در تشخیص آزمایشگاهی

روشهایی که جهت شناسایی عوامل عفونی بیماری ها به کار می روند، شامل کشت میکروبی، روشهای سرولوژیک و روش های مولکولی می باشند، کشت میکروبی نیاز به زمان طولانی برای رسیدن به پاسخ دارد و این در حالی است که میکروارگانیسم های بیماری زای مهمی نیز وجود دارند که به سختی قابل کشت بوده یا اصلاً قابل کشت نیستند.

روشهای سرولوژیک نیز دارای معایبی از جمله واکنش متقاطع (Cross Reaction) با عوامل مختلف، عدم حساسیت در تشخیص برخی عفونتهای مادرزادی مانند CMV، عدم کارایی مناسب در افراد دارای نقص ایمنی و نبود تستهای سرولوژیک در مورد برخی از ارگانیسم های بیماریزا می باشند.

 از آنجائیکه شناسایی دقیق و سریع عوامل عفونی از مطالبات مهم جامعه پزشکی می باشد، روشهای مولکولی در موارد زیادی جایگزین روشهای فوق گشته اند. در میان روشهای مولکولی، روش(PCR (Polymerase Chain   Reaction و مشتقات آن از جمله Real-Time PCR گستردگی روزافزونی در شناسایی عوامل عفونت زا یافته اند، این روش که بر مبنای شناسایی و تکثیر ژنوم میکروارگانیسم ها عمل می کند، دارای حساسیت بسیار بالایی در تشخیص می باشد بطوریکه قادر است تعداد بسیار اندک پاتوژنها را که با روشهای دیگر قابل شناسایی نیستند، تشخیص دهد.

این توانایی به طور مثال در مراحل اولیه عفونت که پاتوژن با روشهای دیگر قابل تشخیص نمی باشد، بسیار ارزشمند است. همچنین این روش دارای ویژگی (Specificity) و نیز سرعت پاسخدهی بسیار بالایی می باشد. سرعت پاسخ دهی بالا یکی از ضروریات تشخیص برخی بیماری های حاد عفونی است که به عنوان مثال می توان به بیماریهای عفونی مغزی-نخاعی یا سپتیسمی اشاره کرد که تشخیص سریع عامل عفونت کمک موثری در درمان بیماران می نماید.

مزایای روش PCR

• توانایی تشخیص عوامل عفونی در مراحل ابتدایی که با روش های دیگر قابل شناسایی نیستند .
• دارای بیشترین ویژگی، دقت و سرعت پاسخدهی نسبت به سایر روشهای معمول .
• توانایی در تعیین تعداد عوامل بیماری زا از جمله CMV و HBV,HCV .
• تعیین ژنوتیپ های ویروس ها بخصوص CMV و HBV,HCV .
• تعیین مقومت دارویی عوامل عفونی.

یکی دیگر از مزایای مهم این تکنیک، توانایی آن در تعیین کمیت (Quantity) پاتوژنها می باشد که خصوصاً در مورد برخی عوامل ویروسی مانند ویروسهای عامل هپاتیت C و B ، HIV و CMV  اهمیت فراوانی دارد. همچنین حساسیت، ویژگی و سرعت این روش در تعیین جنسی، گونه و تحت گونه میکروارگانیسم ها (typing) در موارد زیادی مانند تعیین ژنوتیپ ویروس های HSV و HCV می تواند روند درمان بیماری را کاملا تغییر دهد.

با گسترش کاربرد این روش ها، امروزه شناسایی دقیق مقاومت دارویی برخی از پاتوژنها با استفاده از این تکنیکها میسر گشته است. در این راستا شناسایی مقاومت ویروس هپاتیت B به داروی لامیوودین را می توان به عنوان نمونه ذکر نمود که در تصمیم گیری پزشکان جهت ادامه درمان حائز اهمیت فراوانی است با توجه به ویژگیهای مذکور، آزمایشگاه تشخیص طبی سعید با راه اندازی بخش تشخیص مولکولی، اقدام به ارائه خدمات در این زمینه به جامعه پزشکی نموده است.

بخش مذکور با استفاده از کادر علمی مجرب و فناوری های روز و نیز رعایت استانداردهای جهانی در کنترل کیفی آزمایشات؛ شناسایی، کمیت سنجی، تعیین ژنوتیپ و مقاومت دارویی طیف وسیعی از ارگانیسم های بیماری زا به روش مولکولی را در دستور کار خود قرار داده است و آماده تعامل با جامعه پزشکی در راستای بر طرف نمودن نیازهای تشخیصی و برقراری ارتباط علمی می باشد.

تشخیص مولکولی هپاتیت B

ویروس هپاتیت B یک ویروس DNA داراست و مارکرهای آزمایشگاهی که در تشخیص هپاتیت B حائز اهمیت هستند، شامل: anti-HВs ,НBeAg ,НBsAg ,НBV DNAو anti-HВc می باشند که در سرم بیماران قابل شناسائی هستند. به طور معمول تشخيص هپاتيت B با تعيين وجود HBsAg صورت می گیرد و حضور این آنتی ژن در سرم نشانه عفونت می باشد که ممکن است حاد یا مزمن باشد. در این حالت اگر IgM anti-HBC مثبت باشد، نشان دهنده حاد بودن بیماری است.

مارکرهای سرولوژیکی IgM anti-HBC،HBeAg  , HBsAg  و نیز HBV DNA به طور متوسط ۸-۴ هفته پس از رویارویی با ویروس افزایش یافته و به سطح قابل شناسایی می رسند، منفی بودن HBsAg تشخیص هپاتیت  B را رد نمی کند زیرا ۴۶-۱۲ درصد بیماران مبتلا به نوع حاد بیماری ممکن است در زمان آزمایش، HBsAg منفی باشند که این حالت بیشتر به دلیل انجام شدن آزمایش در مرحله بین منفی شدن HBsAg و مثبت شدن anti-HВs رخ می دهد و در اینجا تشخیص IgM anti-HBC بسیار مفید خواهد بود که در عیار بالا یک مارکر عفونت حاد و یا فعال شدن مجدد عفونت مزمن است.

تیتر پائین IgM anti-HBC همراه با HBsAg دلالت بر عفونت قبلی و ایمنی دارد. در نوع فعال هپاتیت B مزمن، حضور مداوم HBeAg و НBV DNA قابل مشاهده است که نشان دهنده تکثیر ویروس و عفونت زایی بالای سرم فرد آلوده است. شناسایی و اندازه گیری کمی DNAویروس ( Viral Load ) جهت شناسایی عفونت حاد باHBV ضروری نیست و تستهای سرولوژیک کافی به نظر می رسند ولی در عفونت مزمن جهت تصمیم گیری در مورد درمان و بررسی وضعیت پاسخ بیمار به آن بسیار اهمیت دارد.

تشخیص حضور DNA ویروس در صورت مثبت بودن HBe Ag  ضروری به نظر نمی رسد ولی به دلیل وقوع موتاسیون هایی در ژنوم ویروس هپاتیت B که منجر به منفی شدن   HBeAg می گردند، تعیین НBV DNA در صورت مثبت بودن HBsAg و منفی بودن HBeAg جهت تعیین تکثیر ویروس ضروری به نظر میرسد، همچنین در موارد هپاتیت B پنهان (Occult hepatitis B) ، تشخیص       НBV DNA فاکتوری مهم جهت شناسایی عفونت می باشد.

 اندازه گیری کمی DNA ویروس می تواند در تصمیم گیری برای درمان موثر باشد به طوری که معمولاً میزان НBV DNA بالاتر از 10⁵ –  10⁴ کپی در میلی لیتر خون به عنوان کاندید درمان در نظر گرفته می شود و نیز چندین یافته نشان داده که در صورتیکه میزان DNA ویروس کم باشد، اینترفرون آلفا پاسخ ضدویروسی پایدارتری ایجاد میکند، در حالی که اگر میزان DNA ویروس زیاد باشد، آنالوگهای نوکلئوزیدی انتخاب بهتری برای درمان هستند، همچنین در مبتلایانی که لامیوودین برای درمان آنها در نظر گرفته می شود، اطمینان از عدم وجود موتاسیون مقاوم به درمان (موتاسیون YMDD) اهمیت دارد که تشخیص این موتاسیون با روشهای مولکولی امکان پذیر است.

به طور کلی در افرادی که به درمان پاسخ می دهند، میزان DNA ویروس به طور قابل ملاحظه ای کاهش می یابد و پاسخ پایدار به درمان به صورت عدم شناسایی НBV DNA به مدت شش ماه پس از درمان توصیف می گردد. همچنین ظهور anti-HBe در بیمارانی که HBeAg مثبت بوده اند، می تواند به عنوان نشانه کاهش تکثیر ویروس و بهبودی بیماری تلقی گردد.

تشخیص مولکولی هپاتیت C

ویروس هپاتیت ( C) HCV یک ویروس RNA دار است و به دلیل جهش هایی که در طول تکثیر از خود نشان می دهد، هتروژنیسیته زیادی دارد به طوری که این ویروس به شش ژنوتیپ و هر ژنوتیپ به چندین تحت گونه تقسیم بندی میگردد. با توجه به عوارض شدید بیماری، شناسایی و پیگیری بیماران مبتلا حائز اهمیت فراوان است و امروزه تستهای آزمایشگاهی مختلفی در این راستا انجام میگیرد که به طور کلی تحت تسو عنوان قابل ارزیابی هستند :

الف) تستهای سرولوژیک که anti-HCV را در سرم یا پلاسما شناسایی میکنند.

ب) تستهای مولکولی که به دو صورت کیفی و کمی انجام شده و شناسایی ژنوم HCV، اندازه گیری میزان ویروس ( Viral Load ) و تعیین ژنوتیپ ویروس را به عهده دارند.

تست اولیه جهت شناسایی عفونت، انجام ELISA جهت نشان دادن anti-HCV می باشد که مزایایی از جمله ارزانی و قابلیت انجام سریع در مقیاس وسیع را دارد، تست مثبت ELISA در جوامع با ریسک پائین مانند اهدا کنندگان خون باید با یک تست آنالیتیک تشخیص آنتی بادی مانند RIBA تایید گردد و در صورتیکه جواب، مثبت یا مشکوک باشد، آزمایشی HCV RNA صورت خواهد گرفت. بر خلاف آن اگر آزمایش ELISA در جوامع با ریسک بالا یا در وضعیتهای مشکوک به عفونت مثبت شود. مستقیماً آزمایش HCV RNAجهت تایید انجام می پذیرد.

در این حالت اگر پاسخ آزمایش ELISA مثبت بوده و  HCV RNAمنفی باشد، باید آزمایش RIBA انجام گیرد که منفی شدن آن نشانه پاسخ مثبت کاذب ELISA می باشد و مثبت شدن آن علامت عفونت بهبود یافته است.

آزمایش RIBA اختصاصی تر ولی مشکلتر، وقت گیرتر و تا حدی گرانتر از ELSA است و حساسیت آن در مقایسه با ELISA کمتر می باشد، علیرغم این که تعیین آنتی بادی عملی ترین روش شناسایی عفونت است ولی عدم تمیز عفونت بهبود یافته از عفونت فعال ( به دلیل حضور آنتی بادی تا چند سال پس از بهبودی) از عیوب این روش می باشد.

HCV RNA در مدت کوتاهی (۳-۱ هفته) پس از رویارویی با ویروس قابل ردیابی است. در حالی که تعیین آنتی بادی به طور متوسط پس از ۸-۶ هفته قابل انجام می باشد. همچنین در نوزادان تازه متولد شده از مادران مبتلا و افراد تحت دیالیز مزمن و گیرندگان پیوند و سایر افرادی که دچار نقص ایمنی هستند و آنتی بادی در آن ها قابل شناسایی نیست، روش تعیین HCV RNA جهت تشخیص عفونت مناسب است.

به دلایل فوق تشخیص RNA این ویروسی به عنوان Gold Standard جهت نشان دادن عفونت فعال ویروسی پذیرفته شده است. آزمایش تعیین کمی HCV RNA و تعیین ژنوتیپ در صورتی باید انجام شود که پیگیری بالینی و درمان بیماری مد نظر باشد.

دو فاکتور اخیر در تعیین طول دوره درمان موثر می باشند میزان پایین RNA ویروس (کمتر از 2×10⁶ کپی یا 8×10⁵ IU در میلی لیتر خون) پیش آگهی بهتری برای درمان دارد و درمان شش ماهه برای این بیماران می تواند کافی باشد و در غیر این صورت، درمان باید یک سال ادامه یابد.

ژنوتیپ های 1 و 4 این ویروس در مقایسه با ژنوتیپ های ۲ و ۳، به اینترفرون مقاوم تر هستند به طوری که درمان یک ساله بیماران مبتلا به ژنوتیپ های ۱ و ۴ در ۵۰-۳۰ درصد موارد منجر به بهبودی می شود در حالی که این درصد در مورد ژنوتیپهای ۲ و ۳ پس از درمان شش ماهه، ۸۰-۶۰ درصد می باشد و بنابراین تعیین ژنوتیپ که فقط یک بار نیاز به انجام آن است. برای تصمیم گیری در مورد طول دوره درمان اهمیت دارد.

پاسخ به درمان به صورت کاهش ۱۰۰ برابری میزان HCV RNA پس از ۱۲ هفته تعریف می شود و پاسخ پایدار ویروسی به درمان به صورت عدم شناسایی HCV RNA به مدت حداقل شش ماه پس از کامل شدن دوره درمان توصیف می گردد.

یک نکته مهم در مورد بیماران مبتلا به هپاتیت C این است که به دلیل مشابه بودن نوع ابتلا و شیوع بالا، عفونت همزمان با ویروس هپاتیت B در این بیماران معمول است ولی HCV قادر است مانع بروز مارکرهای سرولوژیکی ویروس هپاتیت B شود و بنابراین آزمایش تشخیص HBV RNA در مبتلایان به هپاتیت C مزمن ضروری به نظر می رسد زیرا عفونت همزمان به این دو ویروس پیش آگهی وخیم تری دارد و ممکن است باعث مقاومت بیشتر در برابر اینترفرون گردد.

 آزمایش  ) YMDDتست شناسایی مقاومت به لامیوودین  (

یکی از داروهای مطرح در درمان هپاتیت B مزمن، لامیوودین (Lamivudine )می باشد که بر روی قسمتی از DNA Polymerase ویروس که تحت نام موتیف YMDD (مخفف اسیدهای آمینه تیروزین، متیونین، آسپارتات) شناخته می شود، اثر می گذارد.

مصرف این دارو معمولاً چند سال و به صورت روزانه ادامه می یابد. مشکلی که در این راستا ممکن است ایجاد شود، مربوط به مقاومت این ویروس نسبت به دارو میباشد، بدین صورت که اسید آمینه متیونین در موتیف YMDD به والین ( YVDD ) یا ایزولوسین (YIDD) تغییر می یابد و ویروس نسبت به دارو مقاوم می گردد،

این مقاومت از ۹ – ۱۰  ماه پس از شروع درمان ممکن است ایجاد شود و نهایتاً در سالهای دوم تا چهارم پس از شروع درمان در ۳۸ تا ۶۷ درصد بیماران تحت درمان مشاهده می گردد، مقاومت نسبت به دارو موجب عود این بیماری خواهد شد و نیاز به اتخاذ تدابیر دیگری از جمله تغییر دارو به وجود خواهد آمد بنابراین نیاز ضروری به شناسایی مقاومت نسبت به دارو وجود دارد،

در شناسایی جهش مقاوم به دارو، روشهای متعددی از جمله Sequencing، PCR-RFLP، SSP-PCR و Real Time – PCR مورد استفاده قرار می گیرند که اساس تمام آنها بر آنالیز DNA ویروس استوار می باشد و بسته به امکانات آزمایشگاهی و حساسیت روش، یکی از آنها مورد استفاده قرار می گیرد.

HLA-Typing for Celiac Disease

در تشخیص بیماری سلیاک سه روش سرولوژیک،  HLA-Typingو بیوپسی از روده کوچک قابل استفاده هستند . در حالیکه اندوسکوپی و هیستولوژی دئودنوم روش اصلی تشخیص بیماری سلیاک میباشد ولی دو روش دیگر در تشخیص اولیه و نیز در صورت مبهم بودن تست پاتولوژی مورد استفاده قرار می گیرند. پژوهشها نشان داده اند که مستعد بودن به بیماری سلیاک با آلل های خاصی از HLA کلاس II خصوصاً HLA-DQ مرتبط می باشد.

حدود ۹۵ درصد بیماران مبتلا به سلیاک، هترودیمر 2 HLA-DQ را دارند که توسط آلل های DQ A1*02 و DQ    A1*05 کد می شود و حدود ۸۵ درصد دیگر، هترودیمر HLA-DQ 8 را دارند که توسط آلل های DQ A1*032 و DQ B1*0302 کد می گردد.

همچنین در موارد نادر، بیماران فقط یکی از آلل های DQ 2 یعنی DQ A1*05 و DQ B1*02را دارا می باشند. آلل های  HLA-DQها در ۶۵-۴۸ درصد بستگان درجه اول بیمار مبتلا به سلیاک و در ۷۳ درصد بیماران مبتلا به دیابت وابسته به انسولین حضور دارند که نشان دهنده ریسک بالای بیماری سلیاک در این گروه افراد می باشد . سایر افراد با ریسک بالا شامل بیماران مبتلا به تیروئیدیت اتو ایمیون، سندروم های داون، ترنر و ویلیامز، نقص انتخابی IgA (Selective IgA Deficiency  ) یا افراد با علائم آنمی فقر آهن توجیه نشده    (unexplained)و       osteoporesis Premature-onest می باشد.

از آنجائیکه ۴۰-۲۵ درصد جمعیت عادی، حامل 2 DQ یا DQ 8 می باشند، حضور هریک از این هترودیمرها نشانه تشخیص بیماری سلیاک نمی باشد. بنابراین استفاده اولیه تعیین آلل های HLA-DQ، حذف احتمال وجود بیماری سلیاک و استعداد ژنتیکی نسبت به این بیماری می باشد .(Rule-out Test)

این آزمایش خصوصا زمانی انجام می شود که نتیجه پاتولوژی روده کوچک مشکوک است یا روشهای سرولوژیک، بیماری را نشان می دهند ولی آتروفی ویلیهای روده دیده نمی شود یا رژیم غذایی فاقد گلوتن بدون حضور علائم پاتولوژی تجویز می شود و یا اینکه برای بستگان درجه اول فرد، سلیاک تشخیصی داده می شود.

با روش HLA Typing و تعیین استعداد ژنتیکی نسبت به این بیماری ، از بیوپسی غیر ضروری روده کوچک. آزمایشات مداوم سرولوژیک و شروع رژیم غذایی بدون گلوتن خصوصاً در افراد با ریسک بالا جلوگیری می شود. بنابراین این آزمایش برای افراد با ریسک بالای بیماری سلیاک و نیز افرادی که تشخیص بیماری سلیاک در آنها مبهم است، توصیه می گردد.

این در حالی است که تستهای سرولوژیک برای تشخیص اولیه بیماری در افراد با ریسک پائین ابتلا به این بیماری مورد استفاده قرار میگیرد عدم وجود آللهای HLA مرتبط با این بیماری، احتمال وجود بیماری را تقریباً منتفی می کند به طوری که ارزش پیشگویی منفی  (Negative Predictive Value) این تست ۱۰۰–  ۹۵ درصد می باشد. حضور آللهای HLA مرتبط ،به همراه نتیجه مشکوک هیستوپاتولوژی و یا تست مثبت سرولوژیک، نشان دهنده بیماری سلیاک است .

PCR فهرست آزمایشهای مولکولی

———————————————————————————————————————

توجه:

۱- کلیه آزمایش های مولکولی در مدت ۷۲ ساعت پاسخ دهی می شوند.

۲- باتوجه به انجام اکثر آزمایش های مولکولی با سیستم Real Time PCR پاسخگویی به آزمایش های اورژانس درصورت درخواست پزشک در مدت ۱ روز امکان پذیر می باشد.

نکات مهمی که پزشکان محترم می بایست لحاظ نمایند:

آزمایشهای غربالگری ناهنجاریهای کروموزومی جنین از قبیل تریزومی های ۲۱، ۱۸ و ۱۳ در حال حاضر بطور گسترده در آزمایشگاه ها در حال انجام می باشد. متاسفانه فرآیند فعلی، در پاره ای موارد به علت نکات خاصی که مورد غفلت قرار می گیرد منجر به نتایجی می گردد که بیمار و پزشک و آزمایشگاه را دچار مشکل می کند. رعایت آنها می تواند به کاهش خطا و نتایج بهتر و رضایت بیشتر منجر گردد.

۱- مشاوره و توضیحات لازم در مورد چگونگی آزمایشهای غربالگری و نتایج آنها و اقداماتی که متعاقبا” بدنبال نتایج مثبت (ریسک بالا) باید انجام گردد. فرد باردار، این نکته را کاملا” باید دریابد که با انجام این آزمایش با آمار و احتمالات روبرو است.

۲- درخواست صحیح نوع آزمایش که می بایست بر طبق پروتکل دفتر سلامت مادران وزارت بهداشت باشد. این پروتکل به صورت الگوریتم در همین بروشور در دسترس می باشد.

۳- انجام سونوگرافی توسط سونوگرافیست مجربا. هفته بارداری در سه ماه اول باید به درستی و در محدوده ۸۴-۴۵ CRL تخمین زده شود. NT نیز باید بطور صحیح توسط سونوگرافیستی که NT Certified باشد اندازه گیری گردد.

۴- برای حصول به نتیجه معتبر لازم است ، فرد باردار در هفته بارداری مناسب مراجعه نماید. در سه ماه اول، هفته ۱۳-۱۱ و سه ماهه دوم هفته ۱۸-۱۶

۵- از آنجاییکه نتایج غربالگری می بایست با مدین های همان جامعه مقایسه و به صورت Mon گزارش گردند لذا این موضوع بسیار مهم است که آزمایشگاه مورد ارجاع سالانه بیش از ۲۰۰۰ غربالگری داشته باشد تا بتواند از مدین های معتبر و تحت کنترل استفاده نماید.

۶- با توجه به اینکه روش NIPT یا Cell Free DNA به تازگی دردسترس می باشد لذا افراد باردار و پزشکان محترم می توانند از مزایای این روش نیز بهره مند گردند. زمان مراجعه بیجار جهت انجام NIPT هفته ۲۲-۱۱ می باشد.

۷- در صورت صلاحدید پزشک ، افراد با نتیجه ریسک پایین (کمتر از یک هزارم) در سه ماهه اول نیز می توانند از پتانسیل و مزایای روش غربالگری Full IPS بهره مند شوند.

۸- ضروری است که آزمایشات غربالگری سه ماهه اول و دوم هر دو در یک آزمایشگاه انجام گردد.

۹- بارداری های دوقلو به بالا را نمی توان غربالگری کرد.

۱۰- در مورد بارداری های دوقلو اگر یکی از جنین ها مرده باشد و یا ساک حاملگی دیگری باشد که پلاسنتا دارد به علت وجود ترشحات مربوط به آن ، غربالگری بلافاصله قابل انجام نمی باشد و بعد از حذف جنین مرده جهت آزمایش غربالگری سونوگرافی باید تجدید شود.

۱۱- صرفه نظر از نتیجه مثبت یا منفی غربالگری ۳ ماهه اول، آزمایش AFP برای نقص لوله های عصبی و سونوگرافی هدفمند در هفته ۱۸-۱۶ باید انجام شود.

پروتکل درخواست و پیگیری آزمایش اختلالات کروموزومی قبل از تولد